1.不同抗冻剂对栉江珧和近江牡蛎精子保存效果的影响

用不同浓度的DMSO和甘油作为保护剂冷冻精子，解冻激活后检测精子活率。其中，栉江珧冷冻后直接镜检精子活率最高的是8%DMSO处理组，为60.2%；曙红Y染色结果与镜检结果相吻合，即8%DMSO处理组精子活率最高，为55.6%(图1A)。而近江牡蛎冷冻后镜检精子活率最高的是10%DMSO处理组(66.0%)；曙红Y染色结果亦显示10%DMSO保护效果**，为60.9%(图1B)。

2.不同降温程序对栉江珧和近江牡蛎精子保存效果的影响  自增压液氮罐

用终浓度8%和10%的DMSO分别作为栉江珧和近江牡蛎的保护剂，检测A、B、C、D4种不同的降温程序的保护效果。如图2所示，降温程序A对精子的保护效果较差，栉江珧和牡蛎的精子活率分别为26.1%和32.8%(直接镜检)；采用降温程序B处理，栉江珧和牡蛎精子的活率明显上升至46.5%和55.6%(直接镜检)；按照降温程序C进行降温后精子的活率最高，栉江珧达到60.2%(直接镜检)和55.6%(曙红Y染色)，牡蛎达到66.0%(直接镜检)或60.9%(曙红Y染色)；而降温程序D，即直接津入液氮法的保护效果最差，精子活率接近0。

3.精液稀释方式不同对栉江珧和近江牡蛎精子保存效果的影响

DMSO对精子存在一定的毒性，DMSO浓度过高或者作用时间过长都会增加对精子的损伤。DMSO分子渗透进入精子的时间约为30min，在这段时间内采取逐级升高DMSO浓度的方式稀释精液，以减少DMSO的毒性。结果见图3，将抗冻液等分为3份，依次与精子混合的稀释方案对精子的保护效果**，栉江珧镜检和曙红Y染色的精子活率分别达到了63.0%和60.9%，近江牡蛎镜检和曙红Y染色的精子活率分别达到了66.1%和61.8%。

4.不同平衡时间对栉江珧和近江牡蛎精子保存效果的影响

检测不同平衡时间对冷冻效果的影响，如图4所示，栉江珧和近江牡蛎精液在不经4℃平衡时保存效果都最差，栉江珧精子镜检和曙红Y染色检测活率分别为39.0%和34.5%，近江牡蛎为42.0%和36.7%。栉江珧在平衡时间为15min时保存效果**，镜检和曙红Y染色检测活率分别为60.5%和54.9%，近江牡蛎在平衡时间为20min时保存效果**，镜检和曙红Y染色检测活率分别为64.5%和60.0%。利用SPSS软件中的单因素方差法(analy-sisofvariance,ANOVA)分析发现，栉江珧和近江牡蛎平衡15、20和25min的3个样本复苏后精子活率没有统计学差异(P＞0.05)，因此4℃平衡15~25min都有利于精子的冷冻保存。

5.不同样品体积对栉江珧和近江牡蛎精子保存效果的影响

不同保存体积对冷冻效果存在明显的影响，如图5所示。当样品体积为0.2mL时，栉江珧和近江牡蛎精子保存效果都是最差的，低至27.8%和31.7%(镜检)。栉江珧精子活率最高的是1mL体积组，镜检和曙红Y染色分别为60.0%和53.5%；近江牡蛎精子活率最高的也是1mL体积组，镜检和曙红Y染色分别为63.0%和57.1%。1.4mL体积组栉江珧和近江牡蛎精子的活率也较高，直接镜检栉江珧和近江牡蛎精子活率约为56.3%和60.5%，且与1.0mL体积组相比无统计学差异(P＞0.05)。

6.不同保存时间对栉江珧和近江牡蛎精子复苏效果的影响 自增压液氮罐

对同一批样品，分别在冷冻不同天数后解冻复苏统计精子活率。如图6所示，冷冻精子与鲜精冻0d)相比精子活率明显降低，从90%降至60%左右。其中冷冻0.5、1、7和30d组样品间精子活率并无显著差异(P＞0.05)；冷冻180d样品组的精子活率略低于0.5、1、7和30d组样品(P＜0.05)。